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青海省安全生产监督管理规定

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青海省安全生产监督管理规定

青海省人民政府


青海省安全生产监督管理规定

第50号


《青海省安全生产监督管理规定》已经2005年8月27日省人民政府第38次常务会议审议通过,现予公布,自2005年11月1日起施行。


省 长 宋秀岩
二○○五年九月一日



青海省安全生产监督管理规定

第一条 为了加强安全生产监督管理,防止和减少安全生产事故,保障人民群众生命和财产安全,促进经济社会和谐发展,根据《中华人民共和国安全生产法》和有关法律、法规的规定,结合本省实际,制定本规定。
第二条 本省行政区域内安全生产监督管理适用本规定。法律、法规另有规定的,从其规定。
第三条 各级人民政府应当加强对安全生产监督管理工作的领导,支持、督促各有关部门依法履行安全生产监督管理职责,健全安全生产会议制度,定期研究安全生产工作,及时协调解决本地区安全生产监督管理工作中存在的问题。
县级以上人民政府要加大安全生产资金的投入,应当将安全生产监督管理工作经费纳入同级财政预算,将安全生产工作纳入当地国民经济和社会发展规划及总体战略布局,并建立安全生产控制指标体系,实行定量控制和考核。
第四条 各级人民政府应落实安全生产责任制,将安全生产工作纳入各级领导干部年度考核内容。各地区、各部门主要负责人为安全生产工作的第一责任人,对本地区、本部门的安全生产工作负全面领导责任;分管安全生产的负责人负直接领导责任;其他负责人对分管业务范围内的安全生产工作负直接领导责任。
安全生产事故实行责任追究制度,依照有关法律、法规和规章的规定,追究安全生产事故责任人员的法律责任。
  第五条 县级以上人民政府安全生产监督管理部门(以下简称安全监管部门),对本行政区域内的安全生产工作实施综合监督管理。
  县级以上人民政府其他负有安全生产监督管理职责的部门依照有关法律、法规的规定,在各自职责范围内对有关的安全生产工作实施监督管理。
  第六条 工会组织依法监督生产经营单位贯彻执行安全生产法律法规的情况,组织职工参加本单位安全生产工作的民主管理和民主监督,维护职工在安全生产方面的合法权益。
  第七条 各级人民政府应当定期组织开展安全生产宣传教育,提高公民的安全生产意识。
  广播、电视、报刊、网络等新闻单位,应当开展安全生产宣传教育,加强对违反安全生产法律、法规和规章行为的舆论监督。
  第八条 对防止安全生产事故、参加抢险救护、报告重大事故隐患或者举报安全生产违法行为的有功人员,由县级以上人民政府或者安全监管部门给予表彰奖励。
  第九条 对从事煤矿、非煤矿山、建筑施工、危险化学品、道路水路交通运输、民用爆破器材、烟花爆竹等领域生产经营活动的单位按国家有关规定实行安全生产风险抵押金制度。生产经营单位发生生产事故时,安全生产风险抵押金转作事故抢险救灾和善后处理所需资金。
  第十条 按照国家有关规定,高危行业生产经营单位自行提取的安全费用应当专户储存,专项用于安全生产。具体提取标准和管理办法由省安全监管部门会同省财政部门和有关部门制定。
  第十一条 煤矿、非煤矿山、建筑施工等单位和危险化学品、放射性物品、烟花爆竹等生产、经营、储存单位,应当配备专职安全生产管理负责人,设置安全生产管理机构或者配备专职安全生产管理人员,专职安全生产管理人员应按照不低于从业人员百分之二的比例配备。
  前款规定以外的其他生产经营单位,从业人员在三百人以上的,应设置安全生产管理机构,或按照不低于从业人员千分之五的比例配备专职安全生产管理人员;从业人员在三百人以下的,应配备专职或者兼职安全生产管理人员,也可以委托具有国家规定的相关专业技术资格的工程技术人员提供安全生产管理服务。
  第十二条 生产经营单位应当制定安全生产教育和培训计划,建立从业人员安全教育和培训档案。未经安全生产培训合格的从业人员和未取得特种作业操作资格证书的特种作业人员,不得上岗作业。
  煤矿、非煤矿山、建筑施工等单位和危险化学品、放射性物品、烟花爆竹等生产、经营、储存单位的主要负责人和安全生产管理人员,由有关主管部门对其安全生产知识和管理能力考核合格后方可任职。
  第十三条 生产经营单位必须依法参加工伤保险,及时为从业人员足额交纳保险费。
  鼓励高危行业参加人身意外伤害保险。
  第十四条 生产经营单位必须为从业人员无偿提供符合国家标准或者行业标准的劳动防护用品,不得以货币或者其他物品替代。
  第十五条 生产经营单位可以委托有资质的专业中介机构为其安全生产提供技术服务。任何单位和个人不得强令生产经营单位接受其指定的中介机构的服务。
  第十六条 新建、改建、扩建工程项目的安全设施,必须与主体工程同时设计、同时施工、同时投入生产使用,对未通过“三同时”审查的工程项目,安全监管部门不予办理行政许可手续,生产经营单位不准开工投产。
  第十七条 县级以上人民政府应当定期组织有关部门对各类安全事故隐患进行排查,发现安全事故隐患,应责令立即排除,排除前或者排除过程中无法保证安全的,应当做出停产停业或者停止使用有关设施、设备、器材的决定。
  第十八条 县级以上人民政府安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门应当制定安全生产监督检查计划和措施,对生产经营单位的安全生产状况进行定期检查、专项监察或者抽查,指导督促生产经营单位建立健全安全生产责任制,落实各项安全防范措施。
  第十九条 县级以上人民政府安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门应当公布举报电话、通信地址或者电子邮件地址,受理有关安全生产情况的报告或举报,并为举报人保密。受理的报告或举报事项经调查核实后,应当形成书面材料;需要落实整改措施的,报经有关负责人签字并督促落实;对于不属于本部门管辖的,应当及时移送有管辖权的部门处理。
  第二十条 生产经营单位应当建立安全生产报告制度,每季度向当地安全监管部门及其他负有安全生产监督管理职责的部门报告一次安全生产工作情况,重大问题随时报告。
  第二十一条 县级以上人民政府安全监管部门及其他负有安全生产监督管理职责的部门应当采用公告、简报、新闻发布会等形式,每季度向社会公布一次本行政区域内安全生产状况和安全生产事故。
  第二十二条 县级以上人民政府安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门,依法进行安全生产监督检查时,对不符合安全生产的国家标准或者行业标准的设施、设备、器材应当予以查封或扣押。
  第二十三条 县级以上人民政府安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门,对本地区存在的安全事故隐患,超出其管辖范围的,应当立即向有管辖权的上级人民政府或者其他有关部门报告;情况紧急的,可以立即采取暂时停产停业等紧急措施。上级人民政府或者其他有关部门接到报告后,应当立即组织查处。
  第二十四条 县级以上人民政府安全监管部门或者其他负有安全生产监督管理职责的部门,对生产经营单位依法做出责令停产停业、吊销有关证照等行政处罚决定的,应当及时书面通知相关管理部门,相关管理部门在接到书面通知后,应当立即采取相应措施。
  第二十五条 县级以上人民政府应组织有关部门制定本行政区域内安全生产事故应急救援预案,并定期组织演练。预案经同级人民政府主要领导人签署后,报上一级人民政府备案。
  第二十六条 生产经营单位应当根据本单位生产经营的特点,制定安全生产事故应急救援预案,报当地安全生产监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门备案。
  生产经营单位发生安全生产事故后,事故现场有关人员应当立即报告本单位负责人,单位负责人接到事故报告后,应当迅速启动安全生产事故应急救援预案。
  第二十七条 生产经营单位发生安全生产事故,必须立即如实报告事故发生地的安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门,不得瞒报、谎报、迟报。
  第二十八条 安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门,在接到安全生产事故报告后,即按下列程序报告安全生产事故情况:
  (一)一次死亡2人以下,或重伤3人以上9人以下,或一次造成直接经济损失人民币100万元以上,不足500万元的一般安全生产事故,按国家有关规定逐级上报省安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门,并同时报告同级人民政府。
  (二)一次死亡3人以上9人以下,或重伤10人以上49人以下,或一次造成直接经济损失人民币500万元以上,不足1000万元的较大安全生产事故,按国家有关规定逐级上报省安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门。省安全监管部门和其他负有安全生产监督管理职责的部门接到报告后,必须立即上报省人民政府。
  (三)特别重大和重大安全生产事故,按国家有关规定立即上报。
  国家对安全生产事故分级标准另有规定的,其事故报告依照相关分级标准执行。
  第二十九条 生产经营单位发生安全生产事故后,应当派专人保护事故现场,不得故意破坏事故现场、毁灭证据。因抢救人员和财产,防止事故扩大,确需移动现场有关物件的,必须作出标志和书面记录。清理事故现场,应当经事故调查组同意。
  第三十条 对安全生产事故的调查,按下列规定进行:
  (一)特别重大安全生产事故,依照国家规定进行调查;
  (二)重大安全生产事故,由省人民政府授权省安全监管部门组织调查组调查;必要时,由省人民政府组织事故调查组调查;
  (三)较大安全生产事故,由事故发生地州(地、市)人民政府组织事故调查组调查;必要时,由省安全监管部门组织调查组调查;
  (四)一般安全生产事故,由事故发生地县级人民政府组织调查组调查;必要时,由州(地、市)安全监管部门组织调查组调查。
  第三十一条 发生安全生产事故的生产经营单位,应当协助、配合安全生产事故调查组调查。
  第三十二条 安全生产事故调查组由安全监管、公安、监察、工会以及事故发生单位的行业管理或主管部门组成。必要时,聘请有关专家参加事故调查。
  第三十三条 事故调查结束后,安全生产事故调查组应当提交安全生产事故报告,报组织安全生产事故调查组的人民政府或者安全监管部门批复结案。
  第三十四条 监察机关应当加大对本级和下级人民政府负有安全生产监督管理职责的部门及其工作人员履行安全生产监督管理职责的监察,及时查处行政机关工作人员安全生产监督管理工作中的失职和玩忽职守行为。
  第三十五条 违反安全生产监督管理的行为,依照《中华人民共和国安全生产法》和有关法律、法规及《青海省重大安全事故行政责任追究办法》的规定追究法律责任。
  第三十六条 本规定自2005年11月1日起施行。

天津市依法行政考核办法

天津市人民政府


天津市依法行政考核办法

第22号
 《天津市依法行政考核办法》已于2009年10月22日经市人民
政府第37次常务会议通过,现予公布,自2010年1月1日起施行。
                  市长 黄兴国
                二○○九年十月二十九日
        
          天津市依法行政考核办法
  
  第一条 为全面推进依法行政,建设法治政府,根据国务院
《全面推进依法行政实施纲要》(国发〔2004〕10号)和《国务
院关于加强市县政府依法行政的决定》(国发〔2008〕17号)等
有关规定,结合本市实际,制定本办法。
  第二条  依法行政考核应当遵循实事求是、公平公正、科
学严谨、程序简化的原则。
  第三条 市人民政府对区县人民政府、市人民政府有关工作
部门和工作机构依法行政工作进行考核,市全面推进依法行政工
作领导小组办公室负责组织实施。
  区县人民政府对乡镇人民政府、街道办事处和本级人民政府
有关工作部门、工作机构依法行政工作进行考核,区县依法行政
工作领导小组办公室负责组织实施。
   实行垂直管理的区县机构,由区县人民政府和上级行政管
理部门依据不同考核项目分别进行考核,具体考核项目由市全面
推进依法行政工作领导小组确定。
  第四条 依法行政考核下列事项:
  (一)依法履行职责,转变政府职能情况;
  (二)依法、科学、民主决策情况;
  (三)制度建设质量情况;
  (四)深化行政管理体制改革情况;
  (五)规范行政执法行为情况;
  (六)防范化解社会矛盾,应对突发公共事件和防御风险情
况;
  (七)强化行政行为监督制约情况;
  (八)行政责任追究情况;
  (九)依法行政保障措施落实情况;
  (十)市或区县人民政府确定的与依法行政相关的其他事项

  第五条 市人民政府年度依法行政考核具体内容,由市全面
推进依法行政工作领导小组根据国务院和本市依法行政工作重点
、主要工作目标制定,包括年度考核目录、考核标准和考核细则
,并于每年第一季度下发施行。
  各区县人民政府年度依法行政考核具体内容,由各区县依法
行政工作领导小组依据市人民政府年度考核内容制定。
  依法行政年度考核内容及标准应当逐年深化提高。
  第六条 市和区县依法行政工作领导小组办公室在本级依法
行政工作领导小组领导下履行下列考核工作职责:
  (一)拟定年度依法行政考核目录、考核标准、考核细则,
经依法行政工作领导小组同意后公布施行;
  (二)具体组织实施依法行政考核工作;
  (三)提出考核结果建议,报依法行政工作领导小组审定;
  (四)起草年度依法行政考核结果的通报;
  (五)检查验收有关单位依法行政工作整改情况。
  市全面推进依法行政工作领导小组办公室负责对全市依法行
政考核工作的指导、协调、监督。
  第七条 依法行政考核应当坚持日常考核与年终考核相结合
、书面材料审查与现场检查相结合、定性评价与定量考核相结合
、综合考核与专业考核相结合。主要采取下列方式:
  (一) 听取依法行政工作汇报;
  (二) 审阅依法行政工作报告;
  (三) 查阅相关案卷、文件、资料;
  (四) 组织专项检查和抽查;
  (五) 核实依法行政日常工作记录、统计数据;
  (六) 听取人大代表、政协委员、社会监督员意见。
  第八条 市和区县人民政府应当建立各类考核信息资源共享
机制,有关部门或社会团体、组织开展的涉及依法行政考核事项
的专项检查、社会评议结果,可以直接作为依法行政考核的参考
依据,不再重复考核。
  有关部门或社会团体、组织应当提供相关检查评议结果。
  第九条 依法行政考核结果分为优秀、良好、合格、不合格
四个等次。
  第十条 有下列情形之一的,依法行政考核结果确定为不合
格等次:
  (一)未报送年度依法行政工作报告的;
  (二)未达到年度依法行政考核细则中确定的合格标准的;
  (三)经查实在考核中有提供虚假情况、数据等行为的;
  (四)违反重大事项决策程序规则作出决策,造成重大损失
或者恶劣影响的;
  (五)因管理、监督不力,在其职责范围内发生特别重大事
故、事件、案件,或者在较短时间内连续发生重大事故、事件、
案件,造成重大损失或者恶劣影响的;
  (六)因不作为或滥用职权给国家利益、集体利益和公民合
法权益造成严重损害或者引发恶性事件的;
  (七)对群体性、突发性事件处置不当,导致事态恶化,造
成恶劣影响的。
  第十一条 有下列情形之一的,在依法行政考核中应当予以
加分:
  (一)依法行政工作的创新举措被国务院或国家有关部门作
为经验推广的;
  (二)依法行政专项工作成绩突出,获市人民政府或国家有
关部门表彰、奖励的;
  (三)依法行政工作被中央新闻媒体或者本市主要新闻媒体
作为典型经验予以宣传报道的。
  第十二条 被考核单位应当于次年一月上旬报送依法行政工
作书面报告,并按要求报送相关资料,报告内容应当全面、真实
、准确。
  依法行政工作报告应当由被考核单位主要负责人签发。
  不按时报送年度依法行政工作报告和相关资料或者报送的报
告、资料不符合要求的,视为未完成依法行政相关工作。
  第十三条 依法行政年度考核纳入本级政府目标管理考评体
系,与奖惩挂钩。
  考核结果为优秀的单位,市人民政府或区县人民政府应当给
予表彰。
  市或区县人民政府有关工作部门、工作机构考核结果为不合
格的,在本年度政府目标管理考核中不得被评为优秀,并应当向
本级人民政府提交书面检查和整改报告;区县人民政府考结果为
不合格的,向市人民政府提交书面检查和整改报告。整改情况由
依法行政工作领导小组办公室检查验收,向本级人民政府报告。
  第十四条 依法行政考核结果为不合格的单位,按照下列规
定对主要负责人进行问责:
  (一)有本办法第十条第(一)项至第(三)项规定情形的
,由市人民政府或者区县人民政府分管领导约见谈话;
  (二)有本办法第十条第(四)项至第(七)项规定情形的
,按照职责权限由有关部门依据《关于实行党政领导干部问责的
暂行规定》(中办发〔2009〕25号)进行问责。
  第十五条 在依法行政考核中发现被考核单位行政行为涉嫌
违法的,由市或区县依法行政工作领导小组移送有关部门进行查
处;涉嫌犯罪的,移送司法机关处理。
  第十六条 市人民政府或者区县人民政府对年度依法行政考
核结果予以通报,同时抄送同级党委组织部门和人大常委会、政
协以及监察部门。
  第十七条 对中央驻津单位依法行政考核参照本办法执行。
  第十八条 本办法自2010年1月1日起施行。



药品卫生检验方法

卫生部


药品卫生检验方法
卫生部

第一章 药品卫生检验通则
一、供试品取样及注意事项
1.供试品取样应有一定数量,以使检验结果具有代表性。因此,正常的供试品,一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位。检验时,每次最少应分取两瓶(盒)以上的样品共10克或10毫升,中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克;贵重或微量包装的供试品,取样量可酌减

2.凡异常的供试品,则选取有疑问的样品进行检验。
肉眼能看出发霉生虫变质、活螨的样品,应判为不合格,无需再作抽样检验。
3.检查活螨的样品抽样量,见活螨的检验法。
4.供试品在检验前,应严格保持包装的原有状态,不得启开,防止再污染。并放在阴凉干燥处,防止微生物再繁殖,以免影响检验结果。凡已将原包装启开,则无代表性,应另行取样。
5.供试品在检验过程中,从开封至全部检验操作结束,须防止微生物再污染和扩散。凡直接与样品接触的用具,均应事先灭菌并保持无菌;全部操作须在无菌室内进行,或在相应的条件下,按无菌操作规定进行。
6.供试品稀释后,须在1—2小时内操作完毕,防止微生物繁殖或死亡。
7.供试品稀释成供试液后,应在均匀状态下取样。凡因抑菌或不溶于水的剂型,其供试品应作特殊处理后进行检验。
8.从供试品检出大肠杆菌或其它致病菌的报告发出起,该菌种保存一个月备查。如有疑问,可送药检部门或上一级药检单位复核。
二、供试品制备
1.凡固体样品,应称取10克,加在100毫升稀释剂(生理盐水或磷酸盐缓冲液)中,经充分研磨或振摇制成供试液。液体样品,则可量取10毫升加在90毫升稀释剂中,混匀后成供试液。
2.凡含有防腐剂或抑菌成份且影响检验的供试品,可经离心沉淀集菌法及其他适宜的方法处理后,检验大肠杆菌和其他致病菌。集菌处理法如下:
取供试液10毫升,以无菌手续放在灭菌的尖底刻度离心管中,经每分钟3500转以上离心沉淀30分钟,用灭菌毛细吸管吸取上清液弃掉,并留下管底的2毫升残余液,将其全部洗净加在培养基中,进行增菌检验。含有不溶性药渣的样品稀释液,可均匀吸取10毫升放在离心管中
,先经每分钟500转左右离心沉淀5分钟,取其上清液放在另一灭菌尖底刻度离心管中,再经每分钟约3500转以上离心沉淀30分钟,轻轻吸取上清液弃掉,取其管底的2毫升残余液全部洗净加在培养基中,增菌检验即得。
3.非水溶性的软膏、乳膏、油膏剂等,可称取样品5克,放在乳钵或烧杯中,加8毫升灭菌的吐温—80充分研磨匀后,加入经140°干热灭菌半小时的西黄蓍胶2.5克研磨匀。再加少量45°的稀释剂充分研磨,使呈均匀乳剂。随后边加入稀释剂边研磨,使成100毫升乳剂
,移至三角瓶中,即为1∶20供试液。
或称取供试品2.5克,分别量取液体石蜡10毫升,吐温—80.10毫升,稀释剂30毫升。先将供试品置乳钵中,边研磨边滴加液体石蜡;然后再边研磨边滴加吐温—80,研磨均匀后;再边加入稀释剂边研磨,开始每次约1毫升,待起团块时,加入稀释剂3毫升,稍停一分钟
,再轻轻研磨至乳化,将稀释剂加完为止,即得1∶20供试液。
4.滤膜法:取规定量的供试品,按1毫升加入灭菌生理盐水50毫升左右,摇匀,用灭菌吸管或注射器注入薄膜过滤器内,减压抽干后,用灭菌生理盐水或其他适宜的溶剂冲洗薄膜3次,每次50毫升。取出薄膜,剪成几条,加至10毫升灭菌稀释剂中,充分摇动,使成供试液。可
供细菌、酵母菌和霉菌计数用。或将剪成几条的上述薄膜加至有关的增菌培养基中培养,可供检查绿脓杆菌或金黄色葡萄球菌用。
三、阳性菌株对照试验
1.为便于研究观察成药制剂中,某些含有防腐剂和抑菌成份的干扰作用,以及测试常规检验方法和培养基、试剂等的灵敏度时,可将定量的已知阳性对照菌加在供试品稀释液中,按检验供试品的操作方法进行阳性菌的对照试验。阳性对照菌应生长。
2.常用的阳性对照菌株,卫生部检定所编号:大肠杆菌44102、沙门氏菌50094、绿脓杆菌10104、金黄色葡萄球菌26003和破伤风杆菌64067等。
3.对照试验加入的已知活菌量,每批供试品应控制在50—100个范围之内,需氧菌常用的计数方法,如金黄色葡萄球菌可用37℃培养18—20小时
-6
新鲜肉汤培养物,十倍递增稀释至10 ,取其0.1
-7
毫升按琼脂平板表面涂抹法或取10 稀释液1毫升按浇碟法进行活菌数测定。按每毫升菌液内所含的活菌量,取适量加在供试品里,对照检验即得。破伤风杆菌的阳性对照以作毒力试验为主(具体操作见破伤风杆菌检验项下。)



4.作阳性菌株对照试验时,应注意安全,严格防止对照菌污染供试品和环境。为此,加入阳性菌的操作可在另外无菌室或其他适宜的地方进行。

第二章 药品卫生检验法
一、细菌总数测定法
细菌总数的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染的活菌数量。测定结果便于判明供试品被细菌污染的程度,以及生产单位所用的药品原料、工具设备和工艺流程、操作者的卫生状况,是对供试品进行卫生学总评价的综合依据。
1.供试品的测定:
固体供试品,以无菌操作称取若干克,按下列方法之一进行稀释:
(1)将已称取供试品置入灭菌乳钵中加入适量稀释剂,充分研磨,然后移至于灭菌三角瓶中,共加入稀释剂100毫升,使成1∶10均匀供试液。
(2)将已称取的供试品连同100毫升的稀释剂加入灭菌三角瓶或其他相应容器内,进行振荡,使成1∶10的均匀供试液。
液体供试品,可量取10毫升加入90毫升稀释剂,混匀即得。
用1毫升灭菌吸管,吸取1∶10供试液1毫升,沿管壁注入装有9毫升灭菌的稀释剂试管内,混匀即为1∶100稀释液。
另取1毫升灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次,应换用1支1
-3
毫升灭菌吸管并充分混匀,稀释至10 或适当倍数备检。



另用1毫升灭菌吸管1支,按高倍稀释至低倍稀释的顺序分别吸取各稀释度的液体1毫升,注入直径9厘米的平皿内,或在作上述10倍递增稀释时,应稀释妥一稀释度,即可取1毫升稀释液注入平皿内。一般可根据对供试品污染情况的估计,从供试液起选择2—3个适宜稀释度进行
测定,每个稀释度各用2—3个平皿。
稀释液注入平皿后,应及时将熔化并冷至45—50℃的肉汤琼脂培养基倾注平皿内,各约15毫升,随即转动平皿使充分混合均匀。待琼脂凝固后,翻转平板,置37℃培养箱内培养至24小时和48小时,并分别计算平板内生长的的菌落。一般以48小时的菌落数为准。
为减少片状菌落的干扰,也可采用0.001%TTC琼脂,在无菌室开盖倒置或换灭菌的干燥陶瓦盖等方法使平板表面干燥后,再进行培养。
2.菌落计数方法:
先用肉眼观察,点数菌落数(霉菌不包括在内),然后持5—10倍放大镜检查有无遗漏。各平板菌落计数后,求出同一稀释度各平板生长的平均菌落数。如平板中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时,该平板不宜计数。
3、细菌菌数报告:
一般的报告方法是选取同一稀释度平均菌落数在30—300之间的平板,作为菌落总数测定的范围。如每个稀释度使用两个平板,应采用两个平板的菌落平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,或两平板菌落数相差一倍以上,此稀释度不宜采用。如每个稀释度使用三个平板,
应采用三个平板菌落数的平均数,其中有两个平板菌落数较接近,另一个平板相差在一倍以上,或有片状菌落生长时,则应采用前者平均数为该稀释度的菌落数,按下列规则乘其稀释倍数报告之。
稀释度的选择:
(1)若只有一个稀释度,平均菌落数在30—300个之间时,乘以稀释倍数报告之(见表1例1)。
(2)若两个稀释度,其平均菌落数均在30—300个之间,则应求出两者总菌数之比,凡比值小于或等于2应报告其平均数,若大于2则报告其中较小的数字。(见表1例2、3)。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均多于300个,则应按稀释度最高的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例4)。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均少于30个,则应按稀释倍数最低的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间,其中一个稀释度大于300,而相邻的另一稀释度小于30时,则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例6)。
(6)若所有稀释度均无菌生长,报告数为<10个/克或毫升。
菌数的报告,菌数在100以内时,按实有数报告之,大于100时,采用左端前二位数字,在前两位数字之后的数值,应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数,可用10的指数来表示(见表1)。
如供试品经检验,细菌数不合格,需复验时,应重新取样,依法复试两次,细菌数仍有一次不合格时,则该供试品细菌数应判为不合格。
表1 细菌计数结果及报告方法
------------------------------------------------
\ 平均菌| 供试品稀释倍数 |两 数| 菌落 |
\ 落数 |--------------|稀 | 总数 | 细菌总数报告方式
\ | -1| -2| -3|释 之| (个/ | (个/克或毫升)
例 \ |10 |10 |10 |度 | 克或 |
次 \| | | |菌 比| 亳升) |
-----|----|----|----|---|------|----------------
| | | | | | | 4
1 |1365| 164| 20 | — | 16400| 16000|或1.6×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
2 |2760| 295| 46 |1.6| 37750| 38000|或3.8×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
3 |2890| 271| 60 |2.2| 27100| 27000|或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 5
4 |不可计 |4650| 513| — |513000|510000|或5.1×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 2
5 | 27 | 11 | 5 | — | 270 | 270 |或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
6 |不可计 | 305| 12 | — | 30500| 31000|或3.1×10
------------------------------------------------
二、霉菌总数测定法
霉菌总数(包括酵母菌)的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染活的酵母菌、霉菌数量,借以判明供试品的酵母菌、霉菌污染程度及其一般卫生状况。
1.供试品的测定:
供试液与稀释按细菌总数测定项下规定的方法进行。取供试液、1∶100和1∶1000的稀释液各1毫升分别注入平皿内,每个稀释度各用2—3个平皿,加入稀释液后将熔化并冷至45—50°的虎红琼脂培养基约15毫升倾入平皿内,充分摇匀。凝固后,翻转平板置25—2
8°培养72小时,计算平板内生长的霉菌菌落数。若有根霉或毛霉蔓延生长,为避免影响其它霉菌的计数时,应及时将此平板取出计数。
2.酵母菌霉菌菌数报告:
酵母菌、霉菌计数,应选取带有菌丝体的菌落和酵母菌菌落进行点数。先点清每个平板上生长的菌落数,再求出每一稀释度的平均菌落数。判定结果时,应选取平板上菌落数既清楚可数,平均又在5—50个范围以内的菌落数,乘以稀释倍数后,做为供试品的霉菌总数报告之。若有两
个稀释度的菌落数皆在5—50个以内或三个稀释度皆不在此范围之内时,应参照细菌总数测定的规则报告之。
一般眼科制剂的细菌、霉菌总数测定按上述方法进行并报告之。如抗生素或有抑菌作用的制剂,采用适宜的方法处理后,按常规方法进行。
如供试品经检验,霉菌总数不合格,需复检时,应重新取样,依法复试两次。霉菌数仍有一次不合格时,供试品应判为酵母菌、霉菌数不合格。
三、大肠杆菌检验法
大肠杆菌来源于人和温血动物的粪便。凡由供试品中检出大肠杆菌时,表明该药品已被粪便污染,患者服用后,有被粪便中可能存在的其它肠道致病菌和寄生虫卵等病源体感染的危险。因此,大肠杆菌被列为重要的卫生指标菌,是非规定灭菌口服药品的常规必检项目之一。
大肠杆菌检验程序。
表2 肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表
-------------------------------------------------------
| | |爱 | |亚 |枸 |克 | 肠 杆 菌 属 | 沙 雷 氏 菌 属 |
菌属 |艾 |志 |德 |沙 |利 |橼 |雷 |------------|------------|
|希 |贺 |华 |门 |桑 |酸 |伯 | | | 哈夫尼亚 | | | 液化 |
------|氏 |氏 |氏 |氏 |那 |杆 |氏 |阴沟|产气|------|粘 质|红色|-----|
生化特性 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 | | |37℃|22- | | |37℃|22- |
|属 |属 |属 |属 |属 |属 |属 | | | |25℃ | | | |25℃|
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
| | | | | | | | | | | | | | | |
靛基质 |+ |-/+ |+ |- |- |- |-/+ |- |- |- |- |- |- |- |- |
| | | | | | | | | | | | | | | |
甲基红 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |+/- |- |-/+ |-/+ |+/- |-/+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
V-P反应 |- |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |+/- |+ |+ |+ |-/+ |+/- |
| | | | | | | | | | | | | | | |
西蒙氏枸橼 |- |- |- |d |+ |+ |+ |+ |+ |(+) |d |+ |+ |+ |+ |
酸盐 | | | | | | | | | |/- | | | | | |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
硫化氢(三糖|- |- |+ |+ |+ |+/- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |
铁) | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | w | | | | | | w |-, | | |
尿素酶 |- |- |- |- |- |d |+ |+/- |- |- |- |d |+)w |d | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
氰化钾 |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |-/+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
动力 |+/- |- |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
明胶(22℃)|- |- |- |- |(+) |- |- |(+) |-/ | |- |+/ |+ | |+ |
| | | | | | | |/- |(+) | | |(+) | | | |
-------------------------------------------------------

-------------------------------------------------------
赖氨酸脱羧 |d |- |+ |+ |+ |- |+ |- |+ |+ |+ |+ |+/ |+/- |+ |
酶 | | | | | | | | | | | | |(+) | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
精氨酸双水 |d |-/ |- |(+) |+/ |d |- |+ |- |- |- |- |- |- |- |
解酶 | |(+) | |/+ |(+) | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
鸟氨酸脱羧 |d |d |+ |+ |+ |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |
酶 | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
苯丙氨酸脱 |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- | |
氨酶 | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
丙二酸钠 |- |- |- |- |+ |d |+ |+/- |+/- |+/- |d |- |+/- |- | |
-------------------------------------------------------

-------------------------------------------------------
葡萄糖产气 |+ |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+°/- |-/+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
乳糖 |+ |- |- |- |d |(+) |+ |+ |+ |-/ |- |- |+ |d |(+) |
| | | | | |/+ | | | |(+) | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
蔗糖 |d |- |- |- |- |d |+ |+ |+ |d |-/(+) |+ |+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
甘露醇 |+ |+/- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
卫矛醇 |d |d |- |d |- |d |-/+ |-/+ |- |- |- |- |- |- | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
水杨甙 |d |- |- |- |- |d |+ |+/ |+ |d |d |+ |+ |+ | |
| | | | | | | |(+) | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
侧金盏花醇 |- |- |- |- |- |- |+/- |-/+ |+ |- |- |d |+ |d | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
肌醇 |- |- |- |d |- |- |+ |d |+ |- |- |d |d |+ |+ |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
山梨醇 |+ |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |+ |- |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
阿拉伯糖 |+ |d |- |+/ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
| | | |(+) | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
棉子糖 |d |d |- |- |- |d |+ |+ |+ |- |- |- |+ |d |+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
鼠李糖 |d |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |- |
------------------------------------------------------

------------------------------------
| 果胶杆菌属| 形 杆 菌 属 |普罗菲登斯菌属
菌属 |------|--------------|-------
------| | | | | | | |
生化特性 |37℃|22- | | | | | |
| |25℃ |普 通|奇异|摩根氏|雷极氏|产碱|司徒氏
------|--|---|---|--|---|---|--|----
| | | | | | | |
靛基质 |-/+ |-/+ |+ |- |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
甲基红 |-/+ |+/- |+ |+ |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
V-P反应 |-/+ |-/+ |- |-/+ |- |- |- |-
| | | | | | | |
西蒙氏枸橼 |d |+/(+) |d |+/ |- |+ |+ |+
酸盐 | | | |(+) | | | |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
硫化氢(三糖|- |- |+ |+ |- |- |- |-
铁) | | | | | | | |
| | w | | | | | |
尿素酶 |d |d |+ |+/ |+ |+ |- |-
| | | |(+) | | | |
| | | | | | | |
氯化钾 |+/- |+/- |+ |+ |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
动力 |+/- |+/- |+ |+ |+/- |+ |+ |+/-
| | | | | | | |
明胶(22℃)| |+/(+) |+ |+ |- |- |- |-
| | | | | | | |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
赖氨酸脱羧 |- |- |- |- |- |- |- |-
酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
精氨酸双水 |- |-/(+) |- |- |- |- |- |-
解酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
鸟氨酸脱羧 |- |- |- |+ |+ |- |- |-
酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
苯丙氨酸脱 |- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+
氨酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
丙二酸钠 |-/+ |-/+ |- |- |- |- |- |-
------------------------------------

------------------------------------
葡萄糖产气 |-/+ |d |+°/- |+ |d |-/+ |d |-
| | | | | | | |
乳糖 |d |+/(+) |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
蔗糖 |+/- |+ |+ |d |- |d |d |(+)
| | | | | | | |/+
| | | | | | | |
甘露醇 |+/- |+ |- |- |- |+/- |- |d
------|--|---|---|--|---|---|--|----
卫矛醇 |- |- |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
水杨甙 |d |+ |d |d |- |d |- |-
| | | | | | | |
侧金盏花醇 |- |- |- |- |- |d |+ |-
| | | | | | | |
肌醇 |d |- |- |- |- |+ |- |+
------|--|---|---|--|---|---|--|----
山梨醇 |- |- |- |- |- |d |- |d
| | | | | | | |
阿拉伯糖 |d |+ |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
棉子糖 |d |+/(+) |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
鼠李糖 |d |d |- |- |- |+/- |- |-
------------------------------------
注:+90%以上阳性;-90%以上阴性;(+)迟缓阳性;d有不同生化型;“微弱阳性;+°微产气;+/(+)多数阳性,少
数迟缓阳性;(+)/+多数迟缓阳性,少数阳性;+/-多数阳性,少数阴性;-/+多数阴性,少数阳性;-/(+)多数阴
性,少数迟缓阳性;(+)/-多数迟缓阳性,少数阴性;+°/-多数阳性微产气,少数阴性。
大肠杆菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----
↓稀释
-----
|供试液|
-----

--------
|胆盐乳糖增菌|
--------
37°↓18—24小时
------------
|MacC平板或EMB|
------------
37°↓18—24小时
-----
|纯培养|
-----
37°↓18-24小时
-------
|染色、镜检|
-------

---------------
↓ ↓
--------- ------
|IMViC试验| |乳糖发酵|
--------- ------
| |
---------------

-----
|报 告|
-----
(一)增菌培养:
取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
(二)分离培养:
将上述增菌培养物,划线接种于麦康凯琼脂(MacC)或伊红美兰(EMB)琼脂平板上,置37°培养18—24小时,检查有无疑似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、粉红色;在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑
湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选。
(三)纯培养:
至少挑选2—3个疑似大肠杆菌菌落,分别接种于肉汤琼脂斜面或三糖(双糖)铁琼脂斜面,置37°培养18—24小时。
(四)染色镜检:
将疑似大肠杆菌的纯培养物涂片、革兰氏染色。经染色镜检证明,为革兰氏阴性短杆菌者,应继续做生化试验。
(五)生化试验:
1.乳糖发酵试验
将上述纯培养物接种于乳糖发酵管,置37°培养24—48小时,凡大肠杆菌,可发酵乳糖产酸产气,或产酸不产气时,加用酸性复红指示剂的应显红色;加BTB指示剂时显蓝色。产气者,倒管内有气泡。
2.IMViC试验:
①靛基质试验:将纯培养物接种于蛋白胨水,置37°培养24—48小时,沿管壁加柯凡克氏试剂0.3—0.5毫升,轻微摇动,静置片刻,观察液面。阳性反应,液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。
②甲基红试验:将纯培养的菌苔接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37℃培养24—48小时,加入甲基红试剂数滴,观察结果。阳性反应呈鲜红色或桔红色;阴性反应呈黄色。
③V—P试验:将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37°培养48小时,按培立脱法先加6%a-萘酚无水乙醇溶液1毫升,再加40%的氢氧化钾溶液0.4毫升,轻摇后观察结果。阳性反应,加入试剂后,应在15分钟内显红色、深红色。如不明显,可延长至
4小时。
④枸橼酸盐利用试验:将纯培养的菌苔接种于西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面,37°培养24小时,观察结果。阳性反应,斜面有菌苔生长,培养基由绿色变为蓝色。阴性反应斜面无菌苔生长,培养基仍为绿色。当见有微量或痕迹生长的可疑现象时,应将待检菌株分离,纯化后再行试验。


(六)供试品检验报告:
供试品增菌后,在麦康凯或伊红美兰琼脂平板上分离的疑似大肠杆菌,经证实为革兰氏阴性短杆菌,乳糖发酵试验阳性,IMViC试验呈++--或-+--反应者,应即报告供试品检出大肠杆菌。〔注〕
大肠杆菌及其他致病菌检查按一次检出结果为准,不再抽样复试。
〔注〕关于大肠杆菌的IMViC反应的说明
大肠杆菌IMViC试验的模式反应,在一般情况下应为“++--”或将“-+--”也包括在内,共代表了绝大多数大肠杆菌(占99%)的实际反应结果,因而受到了国际上的广泛承认,并将其列为大肠杆菌的常规鉴别IMViC反应公式。但个别大肠杆菌的IMViC反应,
也可能出现“+---”和“++-+”等等异常现象。由于这种异常反应出现的频率极少,没有普遍性的代表意义,因而在分类鉴别和统计学上,可以忽略不计。
四、沙门氏菌检验法
沙门氏菌主要寄生在人体、哺乳动物和家禽的肠道内,可随同粪便的排泄污染水源,食品与药品。沙门氏菌的种类繁多,有些对人有致病力,如伤寒沙门菌和副伤寒沙门氏菌;有些对动物有致病力,如鸭沙门氏菌和雏沙门氏菌;尚有一些对人和动物皆有致病力,如肠炎沙门氏菌、鼠伤
寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等。它们能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等。
带有这些细菌的人与动物常可直接或间接地污染药品的生产环境、工具设备和原料辅料,以及半成品和成品等。特别是用动物脏器制成的药品,污染机率较高,影响患者用药安全,并有可能通过药品的流通而传播。故将沙门氏菌,应列为某些药品的必检项目。
沙门氏菌检验程序。
沙门氏菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----
↓稀释
-----
|供试液|
-----

----------
|胆盐乳糖增菌培养|
----------
37°↓18—24小时
----------
|SS与EMB平板|
----------
37°↓18—24小时
-------
|三糖铁琼脂|
-------
37°↓18—24小时
-------------------------
| | | |
--- --- --- -------------
|动| |镜| |凝| | 一般生化反应 |
| | | | |集| |-----------|
| | | | |试| |葡乳麦甘蔗靛硫尿赖脱氰|
|力| |检| |验| |萄 芽露 基化素氨羧化|
| | | | | | |糖糖糖醇糖质氢酶酸酶钾|
--- --- --- -------------
| | | |
-------------------------

-----
|报 告|
-----
(一)增菌培养:
取1∶10供试品稀释液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
(二)分离培养:
取上述增菌培养物,划线接种于SS琼脂和EMB琼脂平板各一个(划线时,适当增加SS琼脂平板的涂抹量2—3环,可提高阳检率),置37°培养18—24小时。凡沙门氏菌,在SS和EMB琼脂平板上,菌落一般无色透明或半透明,圆形,周边整齐,表面光滑湿润,在SS
琼脂平板上中心有时呈黑褐色。如有上述疑似菌落,应选取2—3个分别进行纯培养,按下列方法鉴别。
(三)初步鉴别:
将上述纯培养物分别穿刺并划线接种三糖铁(TSI)琼脂,置37°培养18—24小时。凡在TSI琼脂中不分解乳糖及蔗糖(即上部斜面呈碱性,不变色),下层底部分解葡萄糖呈酸性变黄色(有气泡或无气泡),有动力或无动力,以及产生或不产生黑褐色的硫化氢反应,并经
涂片染色镜检为革兰氏阴性杆菌,都应继续做生化试验和血清学检查。
(四)生化试验:
取上述疑似菌落的纯培养物、分别接种至葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等发酵管培养基,并接种蛋白胨水和尿素培养基,经37°培养2—5天,观察结果。沙门氏菌一般生化反应和动力检查,绝大数应为、葡萄糖+,乳糖-,麦芽糖+,甘露醇+,蔗糖-,靛基质-,硫化
氢+,尿素酶-,动力+。当一般生化试验符合时,应做赖氨酸脱羧酶及氰化钾试验。沙门氏菌赖氨酸脱羧酶试验+,氰化钾-。系统生化试验,详见表2:肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表。
(五)动力试验:
取上述纯培养物穿刺接种半固体培养基,于37°培养24小时后,观察动力表现。无动力表现的培养物,应在室温(25°左右)保留2—3天后,再观察。
(六)血清学检查:
取上述疑似菌落的TSI琼脂培养物少许,与沙门氏菌A—F多价O血清作玻片凝集试验,并以生理盐水作对照试验。若凝集试验为阴性反应时,应将菌苔制成浓菌液在100℃水浴中保温30分钟后再进行A—F多价O血清凝集试验。将反应结果,结合生化试验,判定之。
(七)供试品检验报告:
凡菌落形态与初步鉴定符合下列情况分别报告如下:
-----------------------------------------
血 清 | A—F多 |生理| 一般|
| 价O血清 | | |
-----------|----------|盐水| 生化| 报告
待 检 菌 | | 100°| | |
-----------| 菌苔 | 03′ |对照| 反应|
顺 序 | | | | |
-----------|----|-----|--|---|-----------
1 | + | | - | 符合|检出沙门氏菌
| | | | |
2 | + | | - |不符合|转有关部门进一步检定
| | | | |
3 | - | + | - | 符合|检出沙门氏菌
| | | | |
4 | - | + |- |不符合|转有关部门进一步检定
| | | | |
5 | - | - |- |不符合|未检出沙门氏菌
| | | | |
6 | - | - |- | 符合|转有关部门进一步检定
-----------------------------------------
五、绿脓杆菌检验法
假单胞菌属的绿脓杆菌对人类有致病力,同药品卫生有关。特别在大面积的烧伤、烫伤患者,眼科疾病和其他外伤方面,常因感染绿脓菌后病情加重,造成患者伤处化脓,并可引起菌血症等,眼角膜溃疡甚至失明,损害病人健康。因此一般眼科制剂和外伤用药,规定不得检出绿脓杆菌

绿脓杆菌检验程序(见次页)。
绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别见表3。
(一)增菌培养:
取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖培养液内,置37°培养18—24小时。
增菌后,如有绿脓杆菌生长,液体表面多有一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
一般滴眼剂如为抗生素或有抑菌作用的供试品,取样4毫升,用滤膜法处理后,将薄膜分成4片,分别接入100毫升的胆盐乳糖增菌液两瓶中,其中一瓶接阳性菌作对照。置37°培养18—24小时。
(二)分离培养:
取上述增菌培养物(应尽量从培养液的薄菌膜部位挑取),划线在十六烷三甲基溴化铵或明胶十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上,置37°培养18—24小时。
凡绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵平板上或在明胶十六烷三甲基溴化铵平板上其菌落扁平无定形周边扩散或略有蔓延,表面湿润,菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性蓝绿色色素,在含有明胶平板上除上述形态外,菌落周围呈现明胶液化环。
挑取疑似绿脓杆菌菌落2—3个进行纯培养。
(三)染色镜检:
挑取疑似菌落纯培养物、涂片、革兰氏染色,经镜检为阴性杆菌者,应进行氧化酶试验。
(四)生化试验
1.氧化酶试验
取一小块白色洁净的滤纸片放在平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌疑似菌落的纯培养物,涂在滤纸片上,然后滴加一滴新鲜配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液于培养物上,在30秒钟之内,纸片上的待检培养物出现粉红色,并逐渐变为紫红色时,即为氧化酶试验阳性。若培养物
不变色,氧化酶试验阴性,供试品可按未检出绿脓杆菌报告。


2.绿脓菌素试验:
挑取纯培养物分别接种在专供测定绿脓菌素用的PDP琼脂斜面培养基上,置37°培养24小时后,在试管内加氯仿3—5毫升,充分振摇,将琼脂斜面培养物中的待检色素提取在氯仿液里。待氯仿提取液呈蓝绿色时,用吸管将其移到另一试管中,并在该液中加1N的盐酸1毫升左
右,振摇后,静置片刻,如果在上层的盐酸液内出现粉红色时,即为阳性,表明被检菌的培养物中有绿脓菌素存在。如阴性,应继续将纯培养物接种在PDP琼脂斜面上,37°培养2—3天后,检查有无绿脓杆菌素产生。
3.硝酸盐还原产气试验:
绿脓杆菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----

-----
|供试液|
-----

--------
|胆盐乳糖增菌|
--------
37° ↓18—24小时
---------------
|十六烷三甲基溴化铵平板或明|
|胶十六烷三甲基溴化铵平板 |
---------------
37° ↓18—24小时
-----
|纯培养|
-----

-------
|染色、镜检|
-------

-------
|氧化酶试验|
-------

(-) -------------------- (+)
↓ ↓
阴 性 --------
↓ |绿脓菌素试验|
----- --------
|报 告| (一) ↓ (+)
----- ------------
↓ ↓
----------------- -----
↓ ↓ ↓ |报 告|
-----
------ ------- ---------
|明胶液化| |硝酸盐还原| |42°生长试验|
| 试验 | |产气试验 | | |
------ ------- ---------
| | |
----------------------

-----
|报 告|
-----
表3 绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别表
---------------------------------------------------
|分离 | 色素 | | | | | | | |
鉴 别 培 养 |---|-----------| |氧|氧| |精解|硝 产| |42
| | | | |鞭 |化| | 乙 |氨 |酸 |液|生
-----------|十六烷| 绿 | 萤 | 其 |毛 |葡|化| 酰 |酸 |盐 |化|长
|三甲基| 脓 | 光 | 他 |染 |萄| | 氨 |双 |还 |明|试
菌 种 |溴化铵| 菌 | 色 | 色 |色 |糖|酶| 酶 |水酶|原 气|胶|验
|琼脂 | 素 | 素 | 素 | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
绿脓杆菌 | + |+/-|+/ |+/-|端极|+|+| + |+ | + |+|+
(P. aeruginosa) | | | | |单毛| | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
萤光假单胞菌 |-/+| - |+/-| - |端极|+|+|-/+|+ |-/+|+|-
(P. fluorescens) | | | | |多毛| | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
恶臭假单胞菌 |-/+| - |+/-| - |” |+|+|-/+|+ | - |-|-
(P. putida) | | | | | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
洋葱假单胞菌 |+/-| - | - |-/+|” |+|+| + |- | - |+|+/-
(P. cepacia) | | | | | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---

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